一、樣本制備：打好實驗根基
樣本制備是 WB 實驗的起點，其質量直接決定了后續實驗的成敗。在這個環節，以下因素會對實驗結果產生顯著影響。
1、樣本來源與保存：不同來源的樣本（如細胞、組織等）所含蛋白的種類和豐度存在差異，且組織樣本的取材部位和處理時間也會影響蛋白表達。若樣本保存不當，例如未及時凍存、反復凍融，會導致蛋白質降解、修飾或聚集，進而影響實驗結果的準確性。因此，應根據實驗目的選擇合適的樣本，并在取材后迅速置于液氮中冷凍，然后轉移至 - 80℃冰箱長期保存，盡量減少凍融次數。
２、裂解液的選擇與使用：裂解液的成分和濃度直接影響蛋白質的提取效率和完整性。不同的裂解液適用于不同類型的樣本和蛋白，如 RIPA 裂解液適合提取總蛋白，但對于一些膜蛋白或核蛋白，可能需要使用特殊配方的裂解液。此外，裂解液中蛋白酶抑制劑的添加量和種類也至關重要，若添加不足，蛋白質會被蛋白酶降解；添加過多則可能影響后續的蛋白定量和電泳。在使用裂解液時，需充分裂解樣本，確保細胞或組織完全破碎，同時注意裂解的溫度和時間，避免蛋白質變性。
3、樣本處理方式：超聲處理、研磨等樣本處理方式能提高蛋白質的提取效率，但如果處理過度，會導致蛋白質片段化；處理不足，則蛋白質提取不充分。因此，需要根據樣本類型優化處理條件，如超聲功率和時間，研磨的力度和次數等。
二、蛋白定量：精準把控實驗起點
準確的蛋白定量是保證實驗結果可靠性和重復性的關鍵，而以下因素會干擾蛋白定量的準確性。
1、定量方法的選擇：常見的蛋白定量方法有 Bradford 法、BCA 法、Lowry 法等，每種方法都有其優缺點和適用范圍。例如，Bradford 法操作簡便、快速，但受去污劑等物質影響較大；BCA 法靈敏度高、受干擾因素較少，但耗時較長。若選擇不當，可能導致定量結果偏差。應根據樣本的特點和實驗需求，合理選擇定量方法，必要時可采用兩種方法相互驗證。
2、標準曲線的繪制：標準曲線是蛋白定量的依據，其準確性直接影響樣本蛋白濃度的計算。標準品的濃度梯度設置不合理、加樣誤差、測量吸光度時的儀器誤差等，都會導致標準曲線偏離真實值。因此，在繪制標準曲線時，要使用高質量的標準品，嚴格按照操作規范進行加樣和測量，重復多次取平均值，確保標準曲線的線性良好。
3、樣本中的干擾物質：樣本中的核酸、去污劑、還原劑等物質可能會與定量試劑發生反應，干擾蛋白定量結果。在定量前，需要對樣本進行適當處理，如使用核酸酶去除核酸，通過透析或超濾等方法去除干擾物質。
三、凝膠制備：搭建蛋白分離舞臺
凝膠是 WB 實驗中分離蛋白質的關鍵介質，凝膠的質量直接影響蛋白質的分離效果。
1、凝膠濃度的選擇：不同濃度的凝膠適用于分離不同分子量的蛋白質。如果凝膠濃度過高，高分子量的蛋白質難以進入凝膠，導致遷移率降低；凝膠濃度過低，低分子量的蛋白質則無法有效分離。因此，應根據目標蛋白的分子量選擇合適的凝膠濃度，如分離小分子蛋白可選用 12%-15% 的凝膠，分離大分子蛋白則適合使用 6%-8% 的凝膠。
2、凝膠制備的操作細節：凝膠制備過程中，試劑的混合比例、聚合時間和溫度等因素都會影響凝膠的質量。例如，過硫酸銨和 TEMED 的用量不當會導致凝膠聚合不完全或過快，影響蛋白質的分離效果；聚合溫度過高或過低也會對凝膠的孔徑和結構產生影響。在制備凝膠時，要嚴格按照配方準確配制試劑，充分混勻后迅速灌膠，并在適宜的溫度下讓凝膠充分聚合。
3、凝膠的均勻性：凝膠的均勻性直接影響蛋白質條帶的清晰度和分辨率。若凝膠在制備過程中出現分層、氣泡或不均勻聚合，會導致蛋白質遷移異常，出現條帶扭曲、拖尾等現象。因此，在灌膠過程中要確保凝膠溶液緩慢、均勻地注入玻璃板之間，避免產生氣泡，并等待凝膠完全聚合后再進行后續操作。
四、轉膜：確保蛋白完美轉移
轉膜是將凝膠中的蛋白質轉移到膜上的過程，轉膜效率的高低直接關系到后續抗體孵育和檢測的效果。
1、轉膜方法的選擇：常用的轉膜方法有濕轉和半干轉，兩種方法各有優缺點。濕轉效果穩定，轉膜效率高，但操作時間較長；半干轉操作簡便、快速，但對實驗條件要求較高，如電流、電壓的控制。應根據實驗需求和實驗室條件選擇合適的轉膜方法，對于分子量較大的蛋白質，濕轉效果通常更好；對于小分子蛋白，半干轉可能更為適用。
2、轉膜條件的優化：轉膜的時間、電流 / 電壓、溫度等條件會影響蛋白質的轉移效率。轉膜時間過短，蛋白質未完全轉移到膜上；轉膜時間過長，則可能導致蛋白質過度轉移或擴散，影響條帶的清晰度。此外，過高的電流或電壓會產生大量熱量，導致蛋白質變性；溫度過高也會對轉膜效果產生不利影響。在轉膜過程中，需要根據目標蛋白的分子量和凝膠濃度，優化轉膜條件，并在轉膜過程中保持低溫環境，可通過使用冷卻裝置或在冷室中進行轉膜。
3、膜的選擇與處理：常用的轉膜膜材有 PVDF 膜、硝酸纖維素膜（NC 膜）等，不同的膜材對蛋白質的吸附能力和結合特性不同。PVDF 膜機械強度高、蛋白結合能力強，適用于多種檢測方法；NC 膜靈敏度高，但機械強度較差，易破損。此外，膜在使用前需要進行預處理，如 PVDF 膜需用甲醇活化，以增強其對蛋白質的吸附能力。若膜的選擇或處理不當，會導致蛋白質結合不牢固，在后續的洗滌和孵育過程中容易脫落，影響實驗結果。
五、抗體孵育：開啟蛋白檢測開關
抗體孵育是 WB 實驗中特異性識別目標蛋白的關鍵步驟，抗體的質量和孵育條件對檢測結果的靈敏度和特異性有著決定性作用。
1、抗體的選擇：抗體的特異性、效價和親和力是影響實驗結果的關鍵因素。選擇抗體時，要確保其針對目標蛋白的特異性強，避免與其他蛋白發生交叉反應；同時，要關注抗體的效價和親和力，效價過低會導致檢測信號弱，親和力不足則可能無法有效結合目標蛋白。此外，還需根據實驗需求選擇合適的一抗和二抗，如單克隆抗體或多克隆抗體，標記二抗的種類（如 HRP 標記、熒光標記等）。
2、抗體的稀釋與孵育條件：抗體的稀釋比例直接影響檢測信號的強度和背景的高低。稀釋比例過高，抗體濃度不足，檢測信號弱；稀釋比例過低，則會導致非特異性結合增加，背景升高。孵育的時間和溫度也很重要，孵育時間過短，抗體與目標蛋白結合不充分；孵育溫度過高，可能會導致抗體變性或非特異性結合增強。在進行抗體孵育時，需要通過預實驗優化抗體的稀釋比例和孵育條件，如在 4℃下過夜孵育一抗，以獲得最佳的檢測效果。
3、洗滌條件：洗滌是去除未結合抗體和雜質的重要環節，洗滌不充分會導致背景過高，影響條帶的清晰度；過度洗滌則可能使已結合的抗體脫落，降低檢測信號。洗滌液的成分、洗滌次數和時間都需要嚴格控制，一般使用含有 Tween-20 的 TBST 或 PBST 緩沖液進行洗滌，洗滌 3-5 次，每次 5-10 分鐘。
六、成像檢測：捕捉蛋白最終信號
成像檢測是 WB 實驗的最后一步，其結果直接反映了目標蛋白的表達情況，而以下因素會影響成像結果的質量。
1、檢測方法的選擇：根據二抗的標記類型，常用的檢測方法有化學發光法和熒光檢測法。化學發光法靈敏度高、操作簡便，但信號持續時間短，需要及時曝光；熒光檢測法可實現多色檢測，分辨率高，但對儀器要求較高，且存在熒光淬滅的問題。應根據實驗需求和實驗室條件選擇合適的檢測方法，若需要檢測低豐度蛋白，化學發光法可能更為合適；若要同時檢測多個目標蛋白，熒光檢測法則具有明顯優勢。
2、成像儀器的參數設置：成像儀器的曝光時間、增益、光圈等參數會影響圖像的亮度、對比度和清晰度。曝光時間過長，會導致條帶過曝，無法準確分析蛋白表達量；曝光時間過短，則信號強度不足，難以檢測到低豐度蛋白。在成像前，需要根據樣本的信號強度，優化儀器參數，可通過預實驗確定最佳的曝光時間和其他參數設置。
3、背景干擾：成像過程中的背景干擾會影響結果的分析和判斷，如膜上的污漬、非特異性結合的抗體、檢測試劑的殘留等都會導致背景升高。在成像前，要確保膜表面干凈，去除多余的檢測試劑；在數據分析時，需要扣除背景值，以獲得準確的蛋白表達量。
Western Blot 實驗是一個環環相扣的復雜過程，每一個步驟都需要我們精心操作、嚴格把控。只有深入了解各步驟中影響結果的關鍵因素，并采取相應的優化措施，才能確保實驗的準確性和可靠性，為科研工作提供堅實的數據支持。希望這篇文章能幫助你在 Western Blot 實驗中少走彎路，順利解鎖蛋白世界的奧秘！
危險品化學品經營許可證（不帶存儲）
營業執照(三證合一)
北京